Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) is a cytosolic enzyme that catalyzes the S-methylation of 6-mercaptopurine and azathioprine. Low-activity phenotypes are correlated with polymorphism in the TPMT gene. Patients with low or undetectable TMPT activity could develop severe myelosuppression when they are treated with standard doses of thiopurine drugs. Since ethnic differences in the TPMT gen polymorphism have been demonstrated worldwide, its assessment in the Chilean population is worthwhile. Aim: To investigate the TMPT gene polymorphism in a Chilean blood donor individuals. Subjects and Methods: The frequency of four allelic variants of the TPMT gene, *2 (G238C), *3A (G460A andA719G), *3B (G460A) and *3C (A719G) were analyzedin 210 Chilean blood donors, using polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP) and allele-specific PCR-based assays. Results: TPMT variants associated to low enzymatic activity, were detected in 16 subjects (8%), who had a heterozygous genotype (*3A in 12; *3C in three and *2 in one subject). No TPMT*3B allelic variant was found. The normal allele (wild-type) was found in 92% ofstudied individuals. Conclusions: The allele TPMT*3A, is the most prevalent in this group of Chilean blood donors, as in Caucasian populations.
(Key words: Blood donors; Genetic polymorphism; Methyltransferases)
La tiopurina S-metiltransferasa (TMPT) representa uno de los ejemplos más notables de cómo la farmacogenética puede contribuir a individualizar un fármaco1. En este sentido, la respuesta al tratamiento con tiopurinas, ya sea azatioprina (AZA) o 6-mercaptopurina (6-MP), que corresponden a fármacos inmunomoduladores que se utilizan en el tratamiento de enfermedades autoinmunes2-5, leucemias6 y en trasplante de órganos7, se podría predecir genéticamente. La AZA es una prodroga que es convertida a 6-MP in vivo, siendo ésta también una prodroga que sufre una serie de reacciones enzimáticas para formar nucleótidos de tioguaninas (6-TGNs), metabolitos activos que pueden ser incorporados al ADN. Dos importantes reacciones inactivan a las drogas tiopurínicas in vivo, la oxidación catalizada por la xantinooxidasa y la S-metilación catalizada por TMPT (Figura 1). Debido a la ausencia de xantinooxidasa a nivel hematopoyético, la metilación por la TMPT tiene un rol preferencial en la metaboli-zación de las drogas tiopurínicas8.
La existencia de polimorfismo en el gen de la TMPT genera variantes alélicas, cuyo fenotipo muestra una capacidad disminuida en la S-metilación de AZA/6-MP, determinando un aumento de los metabolitos activos (6-TGNs), lo que produce una mayor actividad farmacológica, pero también un mayor riesgo de efectos adversos. El gen que codifica para la TPMT se encuentra en el cromosoma 6p22.3, siendo sus alelos heredados de manera codominante y presenta variaciones genéticas que controlan la actividad enzimática9,10.
Esta actividad enzimática variable influye en la biodisponibilidad de las drogas tiopurínicas, determinando su nivel de actividad clínica y el riesgo de efectos adversos dependientes de la dosis, dentro de las cuales destaca la mielosupresión. Se han publicado 21 variantes alélicas para el gen de la TPMT, siendo el alelo TPMT*1 el correspondiente al alelo wild type11,13, el cual es el más frecuente y cuyo fenotipo es de alta actividad enzimática. El resto corresponden a alelos asociados con menor actividad de TPMT, de los cuales los alelos TPMT2, *3A y *3C dan cuenta de casos publicados de la disminución de actividad de la TPMT y se generan como productos de polimorfismos de nucleótido único no sinónimos (SNOs)14 La variante TPMT*2 corresponde a una transverssión, G238→ C que causa la sustitución Ala80Pro, G460 → A y A719 → G, que resultan en las sustituciones Alal54Thr y Tyr240Cys, respectivamente. Para el alelo TPMT*3B se observa sólo la transición G460 → A (Alal54Thr) y en el caso del alelo TPMT*3C existe sólo la transición A719 → G (Tyr240Cys).
Estudios epidemiológicos han demostrado diferencias en las frecuencias alélicas de las distintas variantes del gen de la TPMT según el origen étnico de las poblaciones. Estudios realizados en Latinoamérica muestran una mayor frecuencia de alelo TPMT*3A en sujetos de Argentina15, Colombia16 y Bolivia17, mientras que en la población de Brasil el alelo más frecuente corresponde al TPMT*218. Hasta la fecha no existen estudios sobre el polimorfismo del gen de la TPMT en población chilena. El objetivo de este trabajo es determinar la presencia y prevalencia de los alelos de la TPMT en una población de dadores de sangre.
Material y método
Muestras. Se estudiaron, previo consentimiento informado, 210 muestras de sangre de donantes del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. La edad promedio fue de 34 años, rango 19-68 años, 84 mujeres y 126 hombres. Todos los individuos incluidos en este estudio provienen de familias nacidas en Chile en sus dos últimas generaciones. Las muestras fueron recibidas en tubos con EDTA como anticoagulante y congeladas a -20oC hasta su procesamiento.
Detección de polimorfismos. Se trabajó con ADN genómico obtenido a partir de las muestras de sangre. Para el aislamiento del ADN se utilizó el kit comercial Wizard® Genomic DNA purification (Promega, Madison WI, USA). Los genotipos de TPMT fueron determinados mediante metodologías de PCR descritas previamente19,20. Estos análisis utilizan pares de partidores que incluyen secuencias intrónicas y exónicas para asegurar la amplificación del gen de TPMT y no de un pseudogen existente en el cromosoma 18q21.1.
Detección de G238C. Se realizó PCR alelo específico. En una reacción se utilizaron los partidores P2W (5'-GTATGATTTTAT GCAGGTTTG-3') y P2C (5'-TAAATAGGAACCATCGGACAC-3') para amplificar un segmento de 256 pares de bases (pb) del exón V del gen normal de la TPMT y en otra reacción se utilizaron los partidores P2M (5'-GTATGATTTTATGCAGGTTTC-3') y P2C, los cuales amplifican un segmento de igual tamaño de la variante que lleva la transversión. Para un volumen de reacción de 30 µL, se utilizaron 10 µL de ADN genómico aislado y las concentraciones finales de los reactivos fueron las siguientes: Tris-HCl 10 mM (pH 9), KCl 50 mM, Tritón® X-100 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP's 0,2 mM, partidores 0,5 ^M y 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Promega, Madison WI, USA).
La reacción de amplificación se llevó a cabo en el Termociclador PTC-100 (MJ Research) programado con 40 ciclos a 94oC por 40 s, 55oC por 40 s y 72oC por 1 min, con una extensión final de 10 min a 72oC.
Detección de G460A. Se realizó PCR y RFLP En el PCR se amplificó un segmento de 365 pb del exón VII del gen de la TPMT. Para ello, se utilizaron los partidores P460F (5'-ATAACAGAGTGGGGAGGCTGC-3') y P460R (5'-CTAGAACCCAGAAAAAGTATAG-3')- Para el RFLP, 20 µL del amplicón se incubaron por 1 h a 60^ en presencia de 5 U de la enzima de restricción Mwo I (New England Biolabs, Inc. Beverly. MA, USA). Si no existe la mutación, la enzima corta en un sitio el ADN, generando 2 fragmentos, uno de 267 y otro de 98 pb. La presencia de la sustitución G460A elimina el sitio de corte, por lo tanto el amplificado queda del tamaño original.
Detección de A719G. Se realizó PCR-RFLP. En el PCR se amplificó un segmento de 236 pb del exón X del gen de TPMT. Para ello se utilizó los partidores P719F (5'- AATCCCTGATGTCATTCTT-CATAGTATTT-3') y P719R (5'-CAGGCTTTAGCA-TAATTTTCAATTCCTC-3')- Para el RFLP, 20 µL del amplicón se incubaron por 2 h a 37oC en presencia de 5 U de la enzima de restricción Acc I (New England Biolabs, Inc. Beverly, MA, USA). Si no existe la mutación, la enzima no corta el ADN amplificado, quedando del tamaño original. La presencia de la sustitución A719G genera un sitio de restricción, lo que da origen a 2 fragmentos, uno de 150 y otro de 86 pb.
Para todas las reacciones antes señaladas, las detecciones de los productos amplificados y de los fragmentos de restricción fueron detectados en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, visualizados con luz ultravioleta y fotografiados.
Estadística. Para el cálculo de tamaño muestral, se utilizó un universo de 200 donantes de sangre que mensualmente acude al banco de sangre. Con este universo, para una prevalencia de variación del factor α estudiar de 5%, y un error de 5%, el tamaño muestral requerido era de 139 sujetos.
Se utilizó la prueba de 
para establecer si la población de dadores de sangre se encontraba en equilibrio genético de Hardy-Weinberg para el locus TPMT. Mediante el uso del sistema ABO y Rh como marcadores genéticos, se estimó el porcentaje de mezcla caucásica de la muestra poblacional. Para ello se utilizó los datos de frecuencias publicadas para población española21: ABO-O =0,65; RHD*d = 0,41 y aborígenes chilenos22-23: ABO-O = 0,98; RHD*d = 0,0.
Resultados
De los 210 sujetos estudiados, 16 presentaban alguna de las variantes alélicas mencionadas (7,6%), todos con carácter heterocigoto, siendo de estos 9 hombres y 7 mujeres. En las Tablas 1 y 2 se muestran las frecuencias genotípicas y alélicas, respectivamente. Como se puede observar, el genotipo wild-type es el más frecuente, seguido por la variante TPMT*3A. Ningún individuo presentó la variante TMPT*3B.