La microbiología ha sido durante muchos años una disciplina muy manual, basada en cultivos, realización de pruebas bioquímicas o en la observación de características físicas y de tinción. El diagnóstico de las enfermedades infecciosas ha ido cambiando de forma muy notable en los últimos años debido a los avances en técnicas de diagnóstico, basados en la biología molecular. Estas técnicas permiten establecer el diagnóstico de forma mucho más precoz y fiable, a la vez que permiten la monitorización de la enfermedad, establecer su pronóstico y aumentar la supervivencia. Entre las técnicas de biología molecular, existen muchas variantes para amplificar, detectar y secuenciar los ácidos nucleicos (ADN o ARN en función de la sospecha clínica). La técnica más básica es la reacción en cadena de la polimerasa y sobre esta se han ido desarrollando diferentes modificaciones para mejorar el proceso de diagnóstico e interpretación, entre ellas, la PCR en tiempo real o cuantitativa, la RT-PCR, los microarrays y la secuenciación. A lo largo del trabajo, se detallan diferentes técnicas que permiten el análisis de diferentes muestras para uno o múltiples microorganismos (mediante la utilización de paneles).
Palabras clave:
Diagnóstico, biología molecular, microorganismo, identificación.
ABSTRACT
Microbiology has been for many years a very manual discipline, based on cultures, performing biochemical tests, or observing physical and staining characteristics. The diagnosis of infectious diseases has changed dramatically in recent years due to advances in diagnostic techniques based on molecular biology. These techniques make it possible to establish the early and reliable diagnosis, while allowing the monitoring of the disease, establishing its prognosis and increasing survival. Among molecular biology techniques, there are many variants to amplify, detect and sequence nucleic acids (DNA or RNA based on clinical suspicion). The basic technique is the polymerase chain reaction and different modifications have been developed on this to improve the diagnostic and interpretation process, including real-time PCR or quantitative PCR, RT-PCR, microarrays and sequencing. Different techniques that allow the analysis of different samples for one or multiple microorganisms (through the use of panels) are detailed in this work.
Keywords:
Diagnosis, molecular biology, microorganism, identification.
1. EVOLUCIÓN DE LA MICROBIOLOGÍA E INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR
Tradicionalmente la microbiología ha sido una disciplina muy manual. Algunas de las razones son la gran diversidad de tipos de muestras que se reciben en el laboratorio de microbiología, el número de microorganismos existentes y el volumen de muestras (mucho menor que un examen bioquímico o hematológico).
Con los grandes avances en los últimos años la microbiología clínica ha cambiado rápidamente. La identificación de microorganismos hasta hace relativamente poco tiempo dependía de un cultivo, la realización de pruebas bioquímicas y la observación de características físicas (morfología de las colonias) y de tinción (tinción de Gram, Ziehl-Neelsen, tinta china…). Posteriormente surgió la espectrometría de masas y esta se aplicó a la identificación de microorganismos (MALDI-TOF). Esta tecnología permite la identificación de bacterias y hongos en minutos, es económica y fiable en la mayoría de los microorganismos (1).
La bacteriemia se define como la presencia de bacterias en sangre, y se confirma tras el hallazgo de estas en los hemocultivos. Según las características clínicas del paciente, se puede establecer un origen de la infección que haya provocado la diseminación de las bacterias a la sangre. La fungemia se utiliza para designar la presencia de hongos en la sangre, uno de los más frecuentes son las levaduras del género Candida spp., cuya aparición es muy frecuente a partir de infecciones de catéteres. Por otro lado, la viremia se define como la presencia de virus en la sangre (2).
La microbiología clínica es una ciencia basada en la identificación del agente etiológico de una infección y el establecimiento de un tratamiento correcto contra el o los agentes patógenos. Es importante la relación entre el clínico y el laboratorio, por un lado el clínico debe confiar en los resultados obtenidos en el laboratorio y el laboratorio debe garantizar la entrega de resultados exactos y clínicamente importantes lo antes posible.
La identificación precoz de los microorganismos causantes disminuye de forma importante la mortalidad asociada a estos procesos, que puede variar entre un 10% y un 30% según el tipo de paciente, el origen de la infección, el manejo del paciente durante la infección y la rapidez de la identificación e instauración de un tratamiento. La instauración del tratamiento correcto es difícil y dependerá de los síntomas clínicos del paciente y la epidemiología local para conocer posibles resistencias a antibióticos (microorganismos multirresistentes) (2).
El diagnóstico es una etapa crítica en el manejo de los pacientes. La dificultad de detectar muchos patógenos mediante la microbiología clásica ha hecho que se desarrollen nuevos métodos diagnósticos. La microbiología clásica está asociada a inconvenientes como largos periodos de crecimiento, condiciones muy especiales de cultivo, muestras mal recogidas que complican la interpretación de los resultados o incluso imposibilitan la obtención de un resultado (3). Todo esto, ha dado paso a nuevos métodos de diagnóstico, entre ellos los basados en biología molecular, que han avanzado mucho en la última década, dando lugar a técnicas muy sensibles y específicas, capaces de detectar y cuantificar pequeñas cantidades de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) y proteínas de microorganismos que pueden aislarse de un cultivo o no ser cultivables in vitro.
El laboratorio de biología molecular es el área diagnóstica de mayor dinamismo y crecimiento en los laboratorios clínicos. Estas técnicas así como la automatización, la nanotecnología y la informática han permitido mejorar el diagnóstico de enfermedades infecciosas y con ello, la instauración temprana de un tratamiento que permita disminuir la morbimortalidad asociada a estas infecciones. Además, han permitido mejoras en la prevención de estas infecciones, por lo que las ventajas son muy importantes (4).
Una prueba diagnóstica ideal debería ser capaz de procesar un pequeño volumen de muestra, ser rápida, técnicamente simple o automatizada, de bajo costo y que no requiriese procesamiento por lotes, es decir, que no sea necesario esperar a reunir varias muestras para su procesamiento. Esto último provocaría retrasos en la entrega de resultados (5).
El aumento de la tasa de infecciones graves causadas por bacterias resistentes a antibióticos ha sido otra de las causas por las que se han intentado encontrar nuevas tecnologías que permitan establecer de forma más rápida los tratamientos y disminuir los errores asociados a tratamientos empíricos (5). Los avances en estas técnicas también han hecho que aumenten los conocimientos sobre la resistencia bacteriana a antibióticos.
Por otro lado, la biología molecular ha permitido tipificar, entendiendo por esto el identificar y caracterizar microorganismos patógenos causantes de brotes infecciosos, la fuente de infección y el patrón de diseminación. La secuenciación de genomas completos de bacterias, virus o patógenos fúngicos se está empleando para la detección de patógenos concretos en brotes epidemiológicos (4).
En cuanto a estas técnicas, existen muchas variantes para amplificar, detectar y secuenciar los ácidos nucleicos. La técnica más utilizada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica posteriormente se acompaña de la detección de la amplificación mediante gel de agarosa con un intercalante inespecífico fluorescente. La PCR en tiempo real se acompaña de la identificación inmediata de la amplificación a través de hibridación con sondas marcadas con un fluorocromo y la medida de la fluorescencia emitida por la sonda. La ventaja de esta técnica es que es rápida y se obtienen resultados en un tiempo de 30 minutos a dos horas.
La secuenciación de los productos amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite identificar bacterias y otros microorganismos comparándolos con secuencias ya conocidas y que están incluidas en múltiples bases de datos. La secuenciación de ARN ribosomal 16S permite detectar e identificar microorganismos no cultivables o que presentan complicaciones en su crecimiento o cultivo. El ARN ribosomal 16S es muy específico de cada bacteria y esto hace que sea una buena diana para la identificación del microorganismo (6).
La introducción en la práctica diaria de nuevas tecnologías tiene ventajas entre las que destacan mejores cifras de sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos, mayor rapidez en la obtención de resultados, mayor automatización y por tanto, capacidad para asumir una mayor carga de trabajo y mejor gestión de la actividad en el laboratorio. En cuanto a las desventajas asociadas, los analizadores e instrumentos necesarios para esta nueva forma de trabajo son equipos muy costosos, que supondrán una gran inversión inicial para el laboratorio (muchos de ellos no se lo podrán permitir). A pesar de todo, se han realizado diversos análisis de costo-efectividad que hacen que esta desventaja sea mínima comparada con las ventajas asociadas a esta tecnología (4).
A la hora de la realización de las técnicas pueden tener diferentes enfoques, pueden ir dirigidas a un único agente patógeno o pueden ir orientadas a varios patógenos a la vez, o incluso a la identificación de posibles patógenos causantes de una patología concreta. Por ejemplo, podemos encontrar sistemas orientados únicamente a la detección de Clostridium difficile o paneles de patógenos bacterianos, parásitos o virus causantes de patología gastrointestinal o respiratoria, entre otras (4). Hay que tener en cuenta cuando se trabaja con paneles de microorganismos, que aunque el resultado sea negativo no se puede excluir la infección, por lo que los estudios de identificación deben continuar.
La utilización de paneles para la identificación del microorganismo causante presenta diferentes ventajas e inconvenientes. Por un lado, destaca la rapidez con la que se obtienen los resultados (y la precoz instauración del tratamiento), la realización de estudios epidemiológicos y la identificación de brotes. Pero por el otro, destaca el alto coste asociado a la realización de estas pruebas, la realización de un panel dirigido a población general y no individualizado, la posible detección de portadores y no pacientes enfermos, posibilidad de obtención resultados falsos positivos y la necesidad en muchos casos de realizar pruebas tradicionales de forma paralela (7).