Rapid Detection of Monogenic Causes

Trasfondo y objetivos

En el síndrome nefrótico resistente a esteroides (SRNS), se conocen >21 causas de un solo gen. Sin embargo, el análisis de mutaciones de todos los genes SRNS conocidos requiere mucho tiempo y dinero. Este informe describe un nuevo método de análisis de mutaciones de alto rendimiento que utiliza una tecnología de microfluidos basada en PCR que permite un análisis rápido y simultáneo de mutaciones de 21 causas de SRNS de un solo gen en una gran cantidad de individuos.

Diseño, entorno, participantes y medidas.

Este estudio evaluó a individuos con SRNS; Se enviaron muestras para el análisis de mutaciones de fuentes internacionales entre 1996 y 2012. Como prueba de principio, se evaluó una cohorte piloto de 48 personas que albergaban mutaciones conocidas en genes SRNS conocidos. Después de mejoras en el método, 48 personas con una causa desconocida de SRNS fueron examinadas en un estudio de diagnóstico posterior. El análisis incluyó 16 genes SRNS recesivos y 5 genes SRNS dominantes. Se aplicó una multiplexación de cebadores de 10 veces, lo que permitió la amplificación basada en PCR de 474 amplicones en 21 genes para 48 muestras de ADN simultáneamente. Cuarenta y ocho personas se indexaron en una PCR de código de barras y se realizó una secuenciación de alto rendimiento. Todas las variantes causantes de enfermedades se confirmaron mediante secuenciación de Sanger.

Resultados

El estudio piloto identificó la causa genética de la enfermedad en 42 de 48 (87,5%) de los individuos afectados. El estudio diagnóstico detectó la causa genética de la enfermedad en 16 de 48 (33%) de los individuos afectados con una causa previamente desconocida de SRNS. Se identificaron siete nuevas mutaciones causantes de enfermedades en PLCE1 (n=5), NPHS1 (n=1) y LAMB2 (n=1) en <3 semanas. El uso de este método podría reducir los costos a 1/29 del costo de la secuenciación de Sanger.

Conclusión

Este enfoque altamente paralelo permite un análisis de mutación rápido (<3 semanas) de 21 genes que se sabe que causan SRNS a un costo muy reducido (1/29) en comparación con las técnicas de análisis de mutación tradicionales. Detecta mutaciones en aproximadamente el 33% de los casos de SRNS de inicio en la infancia.

Palabras clave: síndrome nefrótico, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, enfermedad renal genética, genética humana, genética molecular

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Introducción

El síndrome nefrótico (SN) se caracteriza por las características de edema, proteinuria, hipoalbuminemia e hipertrigliceridemia. Los casos de NS se pueden separar en dos clases: NS sensible a los esteroides y NS resistente a los esteroides (SRNS). En el síndrome nefrótico de inicio en la infancia, el 80 % de los pacientes son sensibles a los esteroides con la característica histológica de síndrome nefrótico de cambios mínimos. Aproximadamente entre el 63 % y el 73 % de los pacientes con SRNS de inicio en la infancia suelen tener características histológicas renales de GEFS (1,2). En particular, en el NS congénito, el examen histológico de la muestra de biopsia renal puede mostrar esclerosis mesangial difusa, lo que representa una forma de desarrollo renal de SRNS. El SRNS puede conducir a ESRD (3), que requiere TRS y/o trasplante renal dentro de unos años después del inicio. Recurre en el 30 % de los receptores de trasplantes renales, y causa alrededor del 15 % de todas las ESRD en niños (4).

El SRNS es un trastorno genéticamente heterogéneo. Hasta la fecha, se han identificado >21 causas de un solo gen de NS (o SRNS) (5–8) y muestran herencia dominante y recesiva. Las causas genéticas recesivas de SRNS incluyen los genes NPHS1 (nefrina) (9), NPHS2 (podocina) (10), LAMB2 (subunidad β2 de laminina) (11), PLCE1 (fosfolipasa C, ε1) (12), COQ6 (biosíntesis de coenzima Q10 monooxigenasa 6) (13), SMARCAL1 (regulador dependiente de actina asociado a matriz relacionada con Swi/Snf de la proteína similar a la subfamilia de la cromatina) (14), COQ2 (biosíntesis de coenzima Q10 monooxigenasa 2) (15), PDSS2 (decaprenil-difosfato subunidad de sintasa 2) (16), CD2AP (proteína asociada a CD2) (17), SCARB2 (receptor depurador clase b miembro 2) (18), CFH (factor de complemento 2) (19), CUBN (cubilina) (20), PTPRO (receptor de proteína-tirosina fosfatasa tipo O) (21), MYO1E (miosina 1E) (22,23), NEIL1 (endonucleasa VIII similar a 1) (23) e ITGA3 (integrina-α3) (24).

Se han descrito causas dominantes de un solo gen de SRNS para los genes ACTN4 (actinina-α4) (25), LMX1B (factor de transcripción homeobox LIM 1-β) (26), TRPC6 (canal catiónico potencial receptor transitorio, subfamilia C, miembro 6 ) (27), e INF2 (forma invertida 2) (28). El gen dominante WT1 (tumor de Wilms 1) (29) también causa SRNS de inicio en la infancia.

El análisis de mutaciones generalmente se realiza siguiendo un cierto algoritmo de genotipo-fenotipo, donde los genes que se sabe que están mutados en un fenotipo específico se priorizan antes que otros (30). Por ejemplo, el SN congénito se define por el inicio dentro de los primeros 90 días de vida (5,30,31), y se priorizaría el análisis de mutaciones en NPHS1 antes de la detección de NPHS2 o PLCE1. De manera similar, si un paciente presentara el síndrome de Pierson, LAMB2 se seleccionaría preferentemente para el análisis de mutaciones sobre otros genes SRNS. Además de la variación fenotípica entre diferentes genes, existen diferentes fenotipos entre diferentes alelos dentro del mismo gen. Las mutaciones de NPHS2 causan del 10 % al 28 % de todos los casos de SRNS no familiar en la niñez (32), y diferentes alelos recesivos determinan la edad de aparición de SRNS y ESRD (33–35). Por ejemplo, un homo

Background and objectives

In steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS), >21 single-gene causes are known. However, mutation analysis of all known SRNS genes is time and cost intensive. This report describes a new high-throughput method of mutation analysis using a PCR-based microfluidic technology that allows rapid simultaneous mutation analysis of 21 single-gene causes of SRNS in a large number of individuals.

Design, setting, participants, & measurements

This study screened individuals with SRNS; samples were submitted for mutation analysis from international sources between 1996 and 2012. For proof of principle, a pilot cohort of 48 individuals who harbored known mutations in known SRNS genes was evaluated. After improvements to the method, 48 individuals with an unknown cause of SRNS were then examined in a subsequent diagnostic study. The analysis included 16 recessive SRNS genes and 5 dominant SRNS genes. A 10-fold primer multiplexing was applied, allowing PCR-based amplification of 474 amplicons in 21 genes for 48 DNA samples simultaneously. Forty-eight individuals were indexed in a barcode PCR, and high-throughput sequencing was performed. All disease-causing variants were confirmed via Sanger sequencing.

Results

The pilot study identified the genetic cause of disease in 42 of 48 (87.5%) of the affected individuals. The diagnostic study detected the genetic cause of disease in 16 of 48 (33%) of the affected individuals with a previously unknown cause of SRNS. Seven novel disease-causing mutations in PLCE1 (n=5), NPHS1 (n=1), and LAMB2 (n=1) were identified in <3 weeks. Use of this method could reduce costs to 1/29th of the cost of Sanger sequencing.

Conclusion

This highly parallel approach allows rapid (<3 weeks) mutation analysis of 21 genes known to cause SRNS at a greatly reduced cost (1/29th) compared with traditional mutation analysis techniques. It detects mutations in about 33% of childhood-onset SRNS cases.

Keywords: nephrotic syndrome, focal segmental glomerulosclerosis, genetic renal disease, human genetics, molecular genetics

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Introduction

Nephrotic syndrome (NS) is characterized by the features of edema, proteinuria, hypoalbuminemia, and hypertriglyceridemia. Cases of NS can be separated into two classes: steroid-sensitive NS and steroid-resistant NS (SRNS). In childhood-onset NS, 80% of patients are steroid sensitive with the histologic feature of minimal-change NS. Approximately 63%–73% of patients with childhood-onset SRNS usually have renal histologic features of FSGS (1,2). In particular, in congenital NS, histologic examination of the kidney biopsy specimen can show diffuse mesangial sclerosis, representing a renal developmental form of SRNS. SRNS may lead to ESRD (3), requiring RRT and/or renal transplantation within a few years after onset. It recurs in 30% of renal transplant recipients, causing about 15% of all ESRD in children (4).

SRNS is a genetically heterogeneous disorder. To date, >21 single-gene causes of NS (or SRNS) have been identified (5–8) and display dominant and recessive inheritance. Recessive genetic causes of SRNS include the genes NPHS1 (nephrin) (9), NPHS2 (podocin) (10), LAMB2 (laminin subunit β2) (11), PLCE1 (phospholipase C, ε1) (12), COQ6 (coenzyme Q10 biosynthesis monooxygenase 6) (13), SMARCAL1 (Swi/Snf-related matrix–associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily a-like protein) (14), COQ2 (coenzyme Q10 biosynthesis monooxygenase 2) (15), PDSS2 (decaprenyl-diphosphate synthase subunit 2) (16), CD2AP (CD2-associated protein) (17), SCARB2 (scavenger receptor class b member 2) (18), CFH (complement factor 2) (19), CUBN (cubilin) (20), PTPRO (protein-tyrosine phosphatase receptor-type O) (21), MYO1E (myosin 1E) (22,23), NEIL1 (endonuclease VIII–like 1) (23), and ITGA3 (integrin-α3) (24).

Dominant single-gene causes of SRNS have been described for the genes ACTN4 (actinin-α4) (25), LMX1B (LIM homeobox transcription factor 1-β) (26), TRPC6 (transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 6) (27), and INF2 (inverted formin 2) (28). The dominant gene WT1 (Wilms’ tumor 1) (29) also causes childhood-onset SRNS.

Mutation analysis is usually performed following a certain genotype-phenotype algorithm, where genes known to be mutated in a specific phenotype are prioritized before others (30). For example, congenital NS is defined by onset within the first 90 days of life (5,30,31), and mutation analysis in NPHS1 would be prioritized before screening for NPHS2 or PLCE1. Similarly, if a patient presented with Pierson syndrome, LAMB2 would be preferentially selected for mutation analysis over other SRNS genes. In addition to phenotypic variation between different genes, varying phenotypes exist between different alleles within the same gene. Mutations of NPHS2 cause 10%–28% of all nonfamilial SRNS cases in childhood (32), and different recessive alleles determine the age of onset of SRNS and ESRD (33–35). For example, a homozygous missense mutation in R138Q leads to onset of SRNS at a median age of 4.7 years, yet a truncating mutation at this same position leads to an earlier onset of SRNS at 1.7 years (34). Another example of an allele-dependent phenotypic variance is the variant R229Q, which is common in people of European ancestry and has an allele frequency of 2.292% (Exome Variant Server, http://evs.gs.washington.edu/EVS/). When this variant is found in trans with another heterozygous mutation in podocin, R229Q causes adult-onset SRNS in up to 15% of all cases (36).